Development of an improved method of fast sequence determination of PRRSV field isolates

Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023

The topic of the implemented project deals with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and its diagnostics. This virus poses a major challenge for the pig industry, not only in terms of health, but also economically. Another difficulty is the detection of the virus. This is mainly due to the high genetic variability between different strains, which complicates the detection by PCR. The focus of the project is therefore to establish an optimized protocol for generating so-called amplicons that cover the entire genome of as many PRRSV-1 strains as possible and can then be analysed using next generation sequencing (NGS). The aim is to develop a universal protocol that can be used to determine the complete genome sequence of PRRSV-1 strains using NGS. The design of the primer pairs, which can amplify as many of the heterogenous PRRSV-1 strains as possible, has a key position here. The amplicons were designed to have a length of about 1,5 kb, so that the genome is covered with 11 amplicons, each overlapping by about 100 nucleotides. An important requirement for the primer design is the increasing number of total sequences available in the gene library. In the course of the project, supernatants of cultivated virus were used for RNA extraction and further processing. cDNA from tissue material, form a diagnostic sample that was also carried along proved to be problematic. For this, the metho would have to be further developed.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Die Themenstellung des durchgeführten Projektes befasst sich mit dem Porcinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom Virus (PRRSV) und dessen Diagnostik. Dieses stellt nicht nur gesundheitlich, sondern auch wirtschaftlich eine große Herausforderung für die Schweine-Industrie dar. Zusätzlich ist auch der Nachweis des Virus erschwert, was vor allem an der hohen genetischen Variabilität zwischen verschiedenen Stämmen liegt und die Detektion mittels PCR verkompliziert. Der Fokus des Projekts liegt daher auf der Etablierung eines optimierten Protokolls, zur Erzeugung von sogenannten Amplikons, die das gesamte Genom möglichst vieler PRRSV-1 Stämme abdecken und die anschließend mittels Next Generation Sequencing (NGS) analysiert werden. Ziel ist es, ein universelles Protokoll zu entwickeln, mit dem das vollständige Genom von PRRSV-1 Stämmen, mittels NGS ermittelt werden kann. Eine Schlüsselstellung hat dabei das Design der verwendeten Primerpaare, die möglichst viele der heterogenen PRRSV-1 Stämme amplifizieren können. Die Amplikons wurden mit Längen von etwa 1,5 kb konzipiert, so dass das Genom mit 11 jeweils um ca. 100 Nukleotide überlappenden Amplikons abgedeckt wird. Eine wichtige Voraussetzung für das Primerdesign ist die zunehmende Zahl an verfügbaren Gesamtsequenzen in der Genbank. Im Zuge der Projektarbeit wurden die Überstände im Labor kultivierter Viren zur RNA-Extraktion und weiteren Bearbeitung verwendet. Eine ebenfalls mitgeführte cDNA aus Gewebematerial einer diagnostischen Probe erwies sich als problematisch. Hierfür müsste die Methode weiterentwickelt werden.

V, 30 Blätter